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液相色谱仪实验操作
点击次数:551 发布时间:2016-11-21


为避免急性运动的影响?所以在末次训练结束后24小时取材?运动组和对照组交替进
行。大鼠称重后?用30mg/耐的戊巴比妥钠腹腔麻醉(lml/Kg体重)?经右颈总动脉取血后?
迅速断头处死。剔除头部皮毛?蒸馏水冲洗干净?立即投入液氮中冷冻储存备用。从背部正
中剪开皮肤?分开腰椎附近的肌肉?暴露椎骨?剪取胸10一腰3部的脊髓(T10一L3;)?立
即投入液氮中冷冻储存备用。立即打开腹腔取出脾脏?去除脂肪组织和被膜?4℃预冷生理
盐水冲洗干净?滤纸吸干?精密天平称重后?迅速用小手术剪刀略微剪碎混合均匀后分成两
份?置于液氮中保存备用。
从液氮中取出大鼠头部?用钳骨钳剪开颅骨?小心取出完整的脑组织?准确剥离下丘脑
结节部和延髓中间部?迅速冰冻待测(各脑区取样范围见表9)。从液氮中取出大鼠脊椎?用
钳骨钳小心剪开椎板?暴露脊髓?准确取出完整的腰l一腰3段脊髓(Ll一L5?)?迅速冰冻
待测。上述操作均在冰盘中进行?若操作过程中样品升温变软难于成形?则置于冰冻切片机
中冷冻?取出继续操作。
 
为准确采集自主神经中枢内相关神经核团的组织?本研究用冰冻切片结合显微放大和图
谱定位技术辅助进行采样。操作如下:剥离的下丘脑结节部、延髓中部和L1一L3段脊髓分
别进行冰冻切片?下丘脑切片厚度 60um?延髓切片厚度 60um?脊髓切片厚度90um。切
片置于10倍放大镜下?根据王平宇《大鼠脑读片提要及图谱》所示?用7号注射器针头采
集相应神经核团部位(下丘脑结节部、迷走神经背核部、脊髓中间外侧核部)的组织?置分析
天平上称重并记录。取得的全部样品置于一80℃冰箱中保存待测。
(2)单胺类神经递质的测定
①样品前处理
取出待测组织?每10Omg组织(或100耐血液)加入预冷的800ul 0.4mol/LHCIO;(含0.1%
抗坏血酸)在冰浴中匀浆。4
o
C下14000r/min?离心两次?每次15分钟。取上清 200ul?加
入预冷的200mol/L的柠檬酸钾缓冲液 100ul。4℃静置lh?14000r/min?离心20min。取上
清 20ul进样。
标准品制备:用ER一182A型电子分析天平称取NE、E、DA、HVA、DOPAC标准品一
定量分别用0.lmol/L的HCL溶液配成 20ug/m1标准液贮备液?分装后放入一80
0
C冷冻贮
存?使用时取各自的标准储备液?分别精确量取该储备液10ul、 25ul· 50ul、100u1、 150ul?
分别置量瓶中?用流动相稀释至lml?摇匀?取20ul注入液相色谱仪?每次进两针?计算平
均峰面积?以峰面积一浓度计算各自的回归方程。
②高压液相色谱一电化学检测法(HPLC一EDC)
.测试指标:
多巴胺(Dopamine?DA)、3?4一二羟基苯乙酸(3?4一dihydroxyphey lacetic acid?DOPAC)、
3一甲氧一4一羟基苯乙酸 (homovanillic acid?HVA)、肾上腺素(epinephrine?E)、去甲肾
上腺素(noradrenaline?NE)。
 
.层析条件
仪器为液相色谱仪(日本岛津公司)和库仑电化学检测器(5600A型?美国ESA公司);流动
相为100mmol/L柠檬酸钠(PH4.O)?100mmol/L的EDTA
2
NA?70mmol/L八烷基硫酸?20%
甲醇;迪马C18柱(美国)?玻璃碳工作电极? Ag/AgCI参比电极;施加电势O~500mv;恒流工
作状态?流速1m1/min;温度(24士l)℃。

为避免急性运动的影响?所以在末次训练结束后24小时取材?运动组和对照组交替进
行。大鼠称重后?用30mg/耐的戊巴比妥钠腹腔麻醉(lml/Kg体重)?经右颈总动脉取血后?
迅速断头处死。剔除头部皮毛?蒸馏水冲洗干净?立即投入液氮中冷冻储存备用。从背部正
中剪开皮肤?分开腰椎附近的肌肉?暴露椎骨?剪取胸10一腰3部的脊髓(T10一L3;)?立
即投入液氮中冷冻储存备用。立即打开腹腔取出脾脏?去除脂肪组织和被膜?4℃预冷生理
盐水冲洗干净?滤纸吸干?精密天平称重后?迅速用小手术剪刀略微剪碎混合均匀后分成两
份?置于液氮中保存备用。
从液氮中取出大鼠头部?用钳骨钳剪开颅骨?小心取出完整的脑组织?准确剥离下丘脑
结节部和延髓中间部?迅速冰冻待测(各脑区取样范围见表9)。从液氮中取出大鼠脊椎?用
钳骨钳小心剪开椎板?暴露脊髓?准确取出完整的腰l一腰3段脊髓(Ll一L5?)?迅速冰冻
待测。上述操作均在冰盘中进行?若操作过程中样品升温变软难于成形?则置于冰冻切片机
中冷冻?取出继续操作。
 
为准确采集自主神经中枢内相关神经核团的组织?本研究用冰冻切片结合显微放大和图
谱定位技术辅助进行采样。操作如下:剥离的下丘脑结节部、延髓中部和L1一L3段脊髓分
别进行冰冻切片?下丘脑切片厚度 60um?延髓切片厚度 60um?脊髓切片厚度90um。切
片置于10倍放大镜下?根据王平宇《大鼠脑读片提要及图谱》所示?用7号注射器针头采
集相应神经核团部位(下丘脑结节部、迷走神经背核部、脊髓中间外侧核部)的组织?置分析
天平上称重并记录。取得的全部样品置于一80℃冰箱中保存待测。
(2)单胺类神经递质的测定
①样品前处理
取出待测组织?每10Omg组织(或100耐血液)加入预冷的800ul 0.4mol/LHCIO;(含0.1%
抗坏血酸)在冰浴中匀浆。4
o
C下14000r/min?离心两次?每次15分钟。取上清 200ul?加
入预冷的200mol/L的柠檬酸钾缓冲液 100ul。4℃静置lh?14000r/min?离心20min。取上
清 20ul进样。
标准品制备:用ER一182A型电子分析天平称取NE、E、DA、HVA、DOPAC标准品一
定量分别用0.lmol/L的HCL溶液配成 20ug/m1标准液贮备液?分装后放入一80
0
C冷冻贮
存?使用时取各自的标准储备液?分别精确量取该储备液10ul、 25ul· 50ul、100u1、 150ul?
分别置量瓶中?用流动相稀释至lml?摇匀?取20ul注入液相色谱仪?每次进两针?计算平
均峰面积?以峰面积一浓度计算各自的回归方程。
②高压液相色谱一电化学检测法(HPLC一EDC)
.测试指标:
多巴胺(Dopamine?DA)、3?4一二羟基苯乙酸(3?4一dihydroxyphey lacetic acid?DOPAC)、
3一甲氧一4一羟基苯乙酸 (homovanillic acid?HVA)、肾上腺素(epinephrine?E)、去甲肾
上腺素(noradrenaline?NE)。
 
.层析条件
仪器为液相色谱仪(日本岛津公司)和库仑电化学检测器(5600A型?美国ESA公司);流动
相为100mmol/L柠檬酸钠(PH4.O)?100mmol/L的EDTA
2
NA?70mmol/L八烷基硫酸?20%
甲醇;迪马C18柱(美国)?玻璃碳工作电极? Ag/AgCI参比电极;施加电势O~500mv;恒流工
作状态?流速1m1/min;温度(24士l)℃。

为避免急性运动的影响?所以在末次训练结束后24小时取材?运动组和对照组交替进
行。大鼠称重后?用30mg/耐的戊巴比妥钠腹腔麻醉(lml/Kg体重)?经右颈总动脉取血后?
迅速断头处死。剔除头部皮毛?蒸馏水冲洗干净?立即投入液氮中冷冻储存备用。从背部正
中剪开皮肤?分开腰椎附近的肌肉?暴露椎骨?剪取胸10一腰3部的脊髓(T10一L3;)?立
即投入液氮中冷冻储存备用。立即打开腹腔取出脾脏?去除脂肪组织和被膜?4℃预冷生理
盐水冲洗干净?滤纸吸干?精密天平称重后?迅速用小手术剪刀略微剪碎混合均匀后分成两
份?置于液氮中保存备用。
从液氮中取出大鼠头部?用钳骨钳剪开颅骨?小心取出完整的脑组织?准确剥离下丘脑
结节部和延髓中间部?迅速冰冻待测(各脑区取样范围见表9)。从液氮中取出大鼠脊椎?用
钳骨钳小心剪开椎板?暴露脊髓?准确取出完整的腰l一腰3段脊髓(Ll一L5?)?迅速冰冻
待测。上述操作均在冰盘中进行?若操作过程中样品升温变软难于成形?则置于冰冻切片机
中冷冻?取出继续操作。
 
为准确采集自主神经中枢内相关神经核团的组织?本研究用冰冻切片结合显微放大和图
谱定位技术辅助进行采样。操作如下:剥离的下丘脑结节部、延髓中部和L1一L3段脊髓分
别进行冰冻切片?下丘脑切片厚度 60um?延髓切片厚度 60um?脊髓切片厚度90um。切
片置于10倍放大镜下?根据王平宇《大鼠脑读片提要及图谱》所示?用7号注射器针头采
集相应神经核团部位(下丘脑结节部、迷走神经背核部、脊髓中间外侧核部)的组织?置分析
天平上称重并记录。取得的全部样品置于一80℃冰箱中保存待测。
(2)单胺类神经递质的测定
①样品前处理
取出待测组织?每10Omg组织(或100耐血液)加入预冷的800ul 0.4mol/LHCIO;(含0.1%
抗坏血酸)在冰浴中匀浆。4
o
C下14000r/min?离心两次?每次15分钟。取上清 200ul?加
入预冷的200mol/L的柠檬酸钾缓冲液 100ul。4℃静置lh?14000r/min?离心20min。取上
清 20ul进样。
标准品制备:用ER一182A型电子分析天平称取NE、E、DA、HVA、DOPAC标准品一
定量分别用0.lmol/L的HCL溶液配成 20ug/m1标准液贮备液?分装后放入一80
0
C冷冻贮
存?使用时取各自的标准储备液?分别精确量取该储备液10ul、 25ul· 50ul、100u1、 150ul?
分别置量瓶中?用流动相稀释至lml?摇匀?取20ul注入液相色谱仪?每次进两针?计算平
均峰面积?以峰面积一浓度计算各自的回归方程。
②高压液相色谱一电化学检测法(HPLC一EDC)
.测试指标:
多巴胺(Dopamine?DA)、3?4一二羟基苯乙酸(3?4一dihydroxyphey lacetic acid?DOPAC)、
3一甲氧一4一羟基苯乙酸 (homovanillic acid?HVA)、肾上腺素(epinephrine?E)、去甲肾
上腺素(noradrenaline?NE)。
 
.层析条件
仪器为液相色谱仪(日本岛津公司)和库仑电化学检测器(5600A型?美国ESA公司);流动
相为100mmol/L柠檬酸钠(PH4.O)?100mmol/L的EDTA
2
NA?70mmol/L八烷基硫酸?20%
甲醇;迪马C18柱(美国)?玻璃碳工作电极? Ag/AgCI参比电极;施加电势O~500mv;恒流工
作状态?流速1m1/min;温度(24士l)℃。

为避免急性运动的影响?所以在末次训练结束后24小时取材?运动组和对照组交替进
行。大鼠称重后?用30mg/耐的戊巴比妥钠腹腔麻醉(lml/Kg体重)?经右颈总动脉取血后?
迅速断头处死。剔除头部皮毛?蒸馏水冲洗干净?立即投入液氮中冷冻储存备用。从背部正
中剪开皮肤?分开腰椎附近的肌肉?暴露椎骨?剪取胸10一腰3部的脊髓(T10一L3;)?立
即投入液氮中冷冻储存备用。立即打开腹腔取出脾脏?去除脂肪组织和被膜?4℃预冷生理
盐水冲洗干净?滤纸吸干?精密天平称重后?迅速用小手术剪刀略微剪碎混合均匀后分成两
份?置于液氮中保存备用。
从液氮中取出大鼠头部?用钳骨钳剪开颅骨?小心取出完整的脑组织?准确剥离下丘脑
结节部和延髓中间部?迅速冰冻待测(各脑区取样范围见表9)。从液氮中取出大鼠脊椎?用
钳骨钳小心剪开椎板?暴露脊髓?准确取出完整的腰l一腰3段脊髓(Ll一L5?)?迅速冰冻
待测。上述操作均在冰盘中进行?若操作过程中样品升温变软难于成形?则置于冰冻切片机
中冷冻?取出继续操作。
 
为准确采集自主神经中枢内相关神经核团的组织?本研究用冰冻切片结合显微放大和图
谱定位技术辅助进行采样。操作如下:剥离的下丘脑结节部、延髓中部和L1一L3段脊髓分
别进行冰冻切片?下丘脑切片厚度 60um?延髓切片厚度 60um?脊髓切片厚度90um。切
片置于10倍放大镜下?根据王平宇《大鼠脑读片提要及图谱》所示?用7号注射器针头采
集相应神经核团部位(下丘脑结节部、迷走神经背核部、脊髓中间外侧核部)的组织?置分析
天平上称重并记录。取得的全部样品置于一80℃冰箱中保存待测。
(2)单胺类神经递质的测定
①样品前处理
取出待测组织?每10Omg组织(或100耐血液)加入预冷的800ul 0.4mol/LHCIO;(含0.1%
抗坏血酸)在冰浴中匀浆。4
o
C下14000r/min?离心两次?每次15分钟。取上清 200ul?加
入预冷的200mol/L的柠檬酸钾缓冲液 100ul。4℃静置lh?14000r/min?离心20min。取上
清 20ul进样。
标准品制备:用ER一182A型电子分析天平称取NE、E、DA、HVA、DOPAC标准品一
定量分别用0.lmol/L的HCL溶液配成 20ug/m1标准液贮备液?分装后放入一80
0
C冷冻贮
存?使用时取各自的标准储备液?分别精确量取该储备液10ul、 25ul· 50ul、100u1、 150ul?
分别置量瓶中?用流动相稀释至lml?摇匀?取20ul注入液相色谱仪?每次进两针?计算平
均峰面积?以峰面积一浓度计算各自的回归方程。
②高压液相色谱一电化学检测法(HPLC一EDC)
.测试指标:
多巴胺(Dopamine?DA)、3?4一二羟基苯乙酸(3?4一dihydroxyphey lacetic acid?DOPAC)、
3一甲氧一4一羟基苯乙酸 (homovanillic acid?HVA)、肾上腺素(epinephrine?E)、去甲肾
上腺素(noradrenaline?NE)。
 
.层析条件
仪器为液相色谱仪(日本岛津公司)和库仑电化学检测器(5600A型?美国ESA公司);流动
相为100mmol/L柠檬酸钠(PH4.O)?100mmol/L的EDTA
2
NA?70mmol/L八烷基硫酸?20%
甲醇;迪马C18柱(美国)?玻璃碳工作电极? Ag/AgCI参比电极;施加电势O~500mv;恒流工
作状态?流速1m1/min;温度(24士l)℃。
 

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